大家好，今天来为大家分享酶切时间的一些知识点，和酶切不能超过16个小时的问题解析，大家要是都明白，那么可以忽略，如果不太清楚的话可以看看本篇文章，相信很大概率可以解决您的问题，接下来我们就一起来看看吧！
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一、快切酶酶切时间过长会怎样
非特异性切割、产物降解、反应终止、反应效率降低。
1、酶与非目标DNA序列结合，导致不必要的切割。
2、长时间的酶切会导致DNA降解，影响后续实验结果。
3、长时间的酶切会导致反应终止，无法完成所需的实验步骤。
4、长时间的酶切会导致酶活性降低，从而影响反应效率。
二、单酶切问题
1、首先明确一个问题，你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗，也就是说你只想把这个质粒切开吗？看你的结果好象这种可能性大些，那样我觉得最有可能是梅切不完全，即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近。
2、建议：首先电泳时要有原质粒作对照，这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了。其次想酶切完全，可延长梅切时间，看你的体系酶的量足够了，而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间。最后若是可以确定两条带中有一条是切开的，则可以利用胶回收纯化的 *** 得到所需的这一载体，在和目的片段连接，注意这时凝胶回收是必要的，但若两条带太相近，则可能切的时候难分离；若是改变实验条件最终完全梅切（只一条带，且和原质粒位置有差异），则可以用加热65度20分钟的（对于37度酶） *** 将酶灭活直接用作连接载体即可，不用回收。
3、以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况，若不是则会切下一小段片段，并且一定要凝胶回收才可得到连接载体。
三、酶切技术的技术问题
1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，优选柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。优选TAKARA的纯化柱试剂盒。
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。
连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作。时间3个小时足已。
a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。
取100μl铺板。也可离心后余100μl。
四、tarkara酶切质粒时间
tarkara酶切质粒时间是四个小时。酶切是根据酶切样品的量跟酶切体系中酶的活性来确定的，是酶切PCR产物的话，跟你所加的保护碱基数目也是有关的。做酶切的时候加的酶都是过量的，切三四个小时，保证获得足够干净的载体，切载体时间太短的话，载体不容易纯化掉，就会混入到你的连接产物中影响连接效率，很难挑到构建的克隆，酶切时间不宜太长，太长的话会把载体给切碎掉，有一些有星号活性的酶，切的时间稍长载体就会碎掉，影响你的实验结果。
五、双酶切37℃一般切多久
双酶切是一种常用的分子生物学技术，用于在特定的DNA序列上引入切口。在实验中，通常使用两种限制性内切酶来进行双酶切。这些限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在该序列的特定位置切割DNA分子。在进行双酶切时，会将目标DNA与适当的缓冲液和限制性内切酶一起反应。温度是一个重要的因素，常规的双酶切反应温度为37℃。这个温度是因为大多数限制性内切酶在37℃下具有较高的活性。切割的时间可以根据实验需要进行调整，但一般情况下，双酶切的反应时间为3-4小时。这个时间足够限制性内切酶与目标DNA发生特异性的结合和切割反应。而对于某些特殊的酶或特定的实验要求，切割时间可能会有所不同。
六、酶切的具体过程 怎么切的
1、完全酶切：用足够的限制性内切酶以充分的时间去处理DNA分子,使DNA中所有可能的靶位点都被切割。
2、部分酶切：限制酶处理DNA时因酶量或反应时间不足,以致DNA的靶位点只有一部分被裂解。
3、完全酶切：长度不均一，是黏性末端，但有可能使目的基因断开，大小不可控。
4、部分酶切：片段长度可控，含有黏性末端便于连接，目的基因完整。
七、双酶切时,是直接用pcr产物就可以,还是需要
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒
酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。
2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：3到1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1，000，000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380bp，则0.03pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524μg。
测DNA浓度测定可使用微量可见光分光光度计或者可以使用艾本德的BioPhotometer核酸蛋白分析仪，注意OD值，一般约1.7-1.9.的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，更好在冰上。时间3个小时足已。
a、一般转化仅需要加入2μl加入至100μl正常的TOP10感受态细胞中，冰浴放置30分钟。
b、再在水浴中42℃热激一般90～120秒钟后，再在冰中放置3分钟。
c、加入800μl无抗生素培养基，37℃全温振荡摇床培养40分钟。
取100μl涂布平板。一般转化质粒不建议离心涂布（除非感受态效价特别低），
1做转化质粒的时候一般不加连接酶。对PCR产物进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为T4连接酶长时间放置在常温下容易活性降低，建议在冰盒中操作。
2对含有AMP-RESISTENCE的质粒涂布时，一般培养基会放置在培养箱中一段时间后才会到感受态中，
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
A酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.
做转化时，也要进行对照.设4个：
A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功，当然要保证感受态，培基，连接酶都'正常'的情况下.
B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物，进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒
C.设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误.
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况.
4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒，图省事最后却更费事.注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-100%的阳性率，所以在后面的挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。
关于酶切时间和酶切不能超过16个小时的介绍到此就结束了，不知道你从中找到你需要的信息了吗 ？如果你还想了解更多这方面的信息，记得收藏关注本站。
